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Pfu DNA Ploymerase是一种来源于嗜热菌Pyrococcus furiosus的高度热稳定的DNA聚合酶，其分子量为90kD。在扩增2kb以下DNA片段时，Pfu DNA Polymerase和Taq DNA Polymerase的扩增效率相近。在准确性要求很高的情况下，须选择Pfu DNA Polymerase。Pfu DNA Polymerase具有3’→5’核酸外切酶活性，它能纠正DNA扩增过程中产生的错配，出错率约为2.6×10^-6，因此是最常用的高保真DNA聚合酶之一。Pfu DNA Polymerase无5’→3’核酸外切酶活性，PCR反应中的延伸速度一般为0.5kb/min，比Taq DNA Polymerase要低，但其热稳定性更好，95℃ 1小时仍保持90%以上的活性，对于GC含量很高的模板，变性温度可以提高到98℃而不影响其活性。Pfu DNA polymerase可以扩增较长的DNA片段，但大多数时候比较适合扩增5kb以下的片段，更长片段的扩增推荐使用其它更适合长片段扩增的DNA聚合酶。Pfu DNA Polymerase的PCR产物为平末端，可加A处理再与T-载体连接或使用平末端克隆载体。

• PCR反应体系
  

  成分	用量
  ddH2O	至50μL
  10×Pfu Buffer (with Mg2+)	5μL
  dNTP Mix (10mM each)	1μL
  模板DNA	optional
  引物1(10μM)	2μL
  引物2(10μM)	2μL
  Pfu DNA Polymerase (2.5U/μL)	1μL

  
  注：
  
  • Mg²⁺终浓度：本品已含有2mM Mg²⁺，如有需要，可适当调整Mg²⁺浓度至2～4mM。
    
  • 聚合酶添加：室温下聚合酶有一定程度的5’-3’聚合酶活性，为了防止非特异性扩增，建议将聚合酶在最后一步加到反应体系中。
    
  • 聚合酶量：推荐使用1μL。可以在0.5～1μL之间进行优化。
    
  • 不同模板的推荐使用量(50μL反应体系)：

    模板种类	扩增片段
    基因组DNA	100ng～1μg
    质粒DNA	10pg～20ng
    cDNA	1～5μL(不超过反应体系的1/10)

• PCR扩增程序
  

  循环步骤	温度	时间	循环数
  预变性	94℃	30sec～3min	1
  变性	94℃	20～30sec	30-35
  退火	55℃	30sec
  延伸	72℃	0.5kb/min
  终延伸	72℃	5～10min	1

  
  注：
  
  • 预变性温度和时间：推荐使用94℃；对于高GC模板，推荐变性温度为98℃。预变性推荐时间：质粒DNA等简单模板为30sec；cDNA、基因组DNA等复杂模板为3min。
    
  • 退火温度和时间：可根据需要，设立温度梯度去摸索引物退火的最适温度。推荐退火时间设置为20sec，可以在10～30sec内调节。退火时间太长可能导致扩增产物在胶上呈弥散状。
    
  • 扩增产物：请将PCR扩增产物放置于-20℃保存，防止DNA发生降解。